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PCR可以擴增環狀質粒,但需要注意的是,PCR擴增環狀質粒的過程與擴增線性DNA有所不同,且擴增后的產物需要經過進一步處理才能形成完整的環狀質粒。以下是對這一問題的詳細解答: 一、PCR擴增環狀質粒的原理環狀質粒PCR構建定點突變序列的基本原理是限制性內切酶Dpn I特異性切割雙鏈DNA中甲基化序列Gm6ATC。從大腸桿菌中分離的質粒已在體內的內源性Dam甲基化酶作用下被完全甲基化了,因而對Dpn I的切割敏感,半甲基化的DNA被Dpn I切割的效率較低。相反,用四種通用脫氧核糖核苷酸體外合成的DNA沒有甲基化,因而完全抵抗切割。在定點突變后,能用Dpn I降解剩余的甲基化了的野生型模板,從而富集體外合成的未甲基化DNA。 二、PCR擴增環狀質粒的步驟- 質粒DNA變性:將質粒DNA溶于水中,加入NaOH和EDTA溶液,在37℃下孵育以變性質粒DNA模板。
- DNA沉淀與收集:通過加入NaAc中和反應液,并用預冷的乙醇沉淀DNA。離心收集變性的質粒DNA,并清洗沉淀后重新溶于水中。
- PCR擴增:以變性的質粒DNA為模板,使用兩條寡苷酸和高保真聚合酶進行PCR擴增。經過多輪熱循環后,全長雙鏈質粒DNA以線性形式擴增,產生一種DNA雙鏈上帶缺口的突變質粒。
- 瓊脂糖凝膠電泳檢查:擴增后,通過瓊脂糖凝膠電泳檢查靶DNA的擴增情況。
- DNA純化:用苯酚-氯仿抽提擴增產物兩次,乙醇沉淀收集DNA。
- DNA磷酸化:將DNA重新溶于噬菌體T4多核苷酸激酶緩沖液中,加入噬菌體T4多核苷酸激酶和ATP進行磷酸化反應。
- 連接反應:使用噬菌體T4 DNA連接酶將磷酸化的DNA進行連接反應,形成環狀閉合質粒。
- Dpn I消化:加入Dpn I緩沖液和Dpn I限制性內切酶,混勻后在37℃下孵育以消化剩余的甲基化模板DNA。
- 轉化與篩選:將消化產物轉化到大腸桿菌感受態細胞中,篩選突變體并通過序列分析進行確證。
三、注意事項- 保真度高的酶:對于較大的質粒,建議使用保真度高的DNA聚合酶以減少錯誤率。
- 循環次數:環狀質粒PCR線性擴增應保持在較少循環次數,以滿足條件必須使用相對大量的模板DNA。
- Dpn I酶的消化過程:如果擴增反應正常但突變體產量低,應懷疑Dpn I酶的消化過程,必要時可調整Dpn I的用量和消化時間。
- 質粒的修復與提取:擴增后形成的帶缺口的環狀質粒需要轉化到宿主中,由宿主細胞內的酶自動修復缺口并形成完整的環狀質粒。之后可以從宿主細胞中提取質粒進行進一步的分析和應用。
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