固相多肽合成儀操作步驟及其基本原理

xiaobaba

固相多肽合成儀操作步驟及基本原理
一、基本原理
1.固相多肽合成（SPPS）通過逐步連接氨基酸殘基構建多肽鏈，其核心原理包括：
固相載體固定：
羧基端（C端）氨基酸通過共價鍵（如酯鍵）固定在樹脂等不溶性載體上，形成反應錨點。
樹脂選擇需考慮化學穩定性及后續切割條件（如TFA或HF裂解）。
2.保護基團策略：
α-氨基保護：常用Fmoc（堿性脫除）或Boc（酸性脫除）基團，防止氨基自反應。
側鏈保護：根據氨基酸特性選擇保護基（如Trt保護半胱氨酸的巰基），避免副反應。
3.脫保護-活化-偶聯循環：
脫保護：去除當前氨基酸的α-氨基保護基，暴露活性氨基（如用哌啶脫Fmoc，TFA脫Boc）。
活化：下一個氨基酸的羧基通過縮合劑（如HBTU/HOBt或DCC/DMAP）活化，形成反應性中間體。
偶聯：活化氨基酸與固相載體上的氨基縮合，形成肽鍵，延長肽鏈。
4.切割與純化：
切割：用強酸（如TFA）裂解肽鏈與樹脂的連接鍵，同時脫除側鏈保護基。
純化：通過HPLC、離子交換色譜等方法去除雜質，獲得目標多肽。
優勢：固相載體便于分離液相雜質，減少中間純化步驟，提高合成效率。


二、操作步驟（以全自動合成儀為例）
1.設備準備與校準
安裝調試：由專業人員安裝設備，檢查溶劑儲液瓶、氣體管道連接，確認儀器各部分完好。
壓力校準：
壓縮空氣（AIR）壓力：60-100 psi
氮氣（N?）壓力：5-10 psi
系統測試：包括泵、閥、檢測器、溫度控制、反應器攪拌等，確保運行正常。
2.反應容器與試劑準備
反應容器選擇：根據合成規模（如0.1-16 mmol）選擇合適樹脂柱，確保材料不與反應物反應。
樹脂處理：
用二氯甲烷（DCM）溶脹樹脂，抽干。
用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗滌樹脂，去除雜質，抽干備用。
試劑配制：
稱量氨基酸、活化試劑（如HBTU）、溶劑（DMF、DCM）等，確保新鮮純凈。
將試劑裝入貼有標簽的儲液瓶，按順序放入合成儀。
3.合成程序設置與啟動
參數設定：
溫度：根據試劑穩定性設定（如室溫至70℃）。
反應時間：脫保護、偶聯步驟時間需優化（通常數分鐘至數小時）。
溶劑流量：通過電磁閥校準，確保精確控制。
序列輸入：在合成儀軟件中輸入目標多肽的氨基酸序列（從C端到N端）。
啟動合成：運行預設程序，儀器自動執行以下步驟：
脫保護：加入脫保護試劑（如20%哌啶/DMF）脫除Fmoc基團，洗滌去除副產物。
偶聯：將活化氨基酸溶液投入反應器，攪拌進行縮合反應。
洗滌：用DMF、DCM等洗滌樹脂，清除未反應物質。
循環重復：直至完成所有氨基酸連接。
4.切割與純化
切割：
配制裂解液（如TFA/水/三異丙基硅烷（TIPS）=95:2.5:2.5），預冷至0℃。
將肽樹脂加入反應釜，加入裂解液，攪拌反應2小時。
抽濾去除樹脂，用TFA洗滌樹脂，合并濾液。
濃縮與沉淀：
旋轉蒸發濃縮濾液至小體積。
加入冷甲基叔丁基醚（MTBE）沉淀多肽，離心收集粗肽。
純化：
使用HPLC（如C18柱）分離目標多肽，流動相為乙腈/水（含0.1% TFA）。
收集目標峰，凍干獲得純品。
5.質量控制與記錄
檢測方法：
紫外檢測：監控脫保護和偶聯步驟的吸光度變化。
質譜分析：確認分子量及純度。
記錄參數：詳細記錄試劑用量、反應時間、溫度、壓力等，生成實驗報告。

三、關鍵注意事項
1.試劑純度：使用高純度試劑（如HPLC級）避免雜質引入。
2.反應監控：通過UV檢測或質譜實時監控反應進程，及時調整參數。
3.設備維護：定期清洗管路、更換密封圈，防止交叉污染。
4.安全操作：裂解液含強酸，需在通風櫥中操作，佩戴防護裝備。

晚點下班

我對這個話題也很感興趣，一起討論吧。

煎餅果子

這么詳實的內容，看得出來樓主花了很多心思，感謝！