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片段分析(Fragment Analysis, FA)的原理主要基于分子生物學技術,特別是針對由PCR(聚合酶鏈式反應)過程所產生的DNA或cDNA片段進行分析。這些片段的大小或標記熒光的差異是分析的關鍵點,廣泛應用于醫學、環境、農業研究等領域的基因型分型、DNA指紋分析、突變檢測等。以下詳細闡述片段分析的原理: 1. 技術基礎- PCR擴增:首先,從生物樣本(如組織、血液、痰液)中提取核酸(DNA或RNA),制備成模板和引物,進行多重PCR擴增。這一步的目的是產生大量的目標DNA片段。
- 熒光標記:在PCR過程中,使用熒光標記的引物進行擴增,使得PCR產物帶有熒光標記。不同大小的片段可以采用不同顏色的熒光進行標記,以便于后續分析。
2. 分離與分析- 電泳分離:擴增后的熒光標記DNA片段通過電泳技術進行分離。電泳方法包括凝膠電泳(如瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳)、高效液相色譜法(HPLC)、變性高效液相色譜分析(DHPLC)以及毛細管電泳等。
- 瓊脂糖凝膠電泳:利用瓊脂糖作為支持介質,通過電場作用使DNA片段根據大小和構型進行分離。
- 聚丙烯酰胺凝膠電泳:分辨率極高,適合分離小片段DNA(5-500bp)。
- HPLC與DHPLC:以液體為流動相,通過高壓輸液系統實現DNA片段的分離和檢測,DHPLC特別適用于基因突變篩查。
- 毛細管電泳:高效、快速、微量,是片段分析中較為先進的技術之一,廣泛應用于先進片段分析(AFA)。
- 熒光檢測:在電泳過程中,利用熒光檢測器對帶有熒光標記的DNA片段進行識別和區分。
3. 數據分析- 軟件分析:通過專門的軟件對電泳結果進行分析,確定DNA片段的大小和基因型。
- 大小分析:軟件利用標準曲線和熒光標記片段的比較,確定片段的相對大小。
- 基因型分析:根據用戶自定義的基因位點來分配等位基因,從而確定基因型。
4. 先進片段分析(AFA)AFA是片段分析中較為領先的技術,其核心內容包括多重PCR技術和毛細電泳系統分離。在同一個PCR反應體系中包含多對引物,各引物特異性地結合相應的目的基因進行多重PCR;通過毛細管電泳系統可對不同片段長度的PCR產物進行分離和識別,同時根據峰面積的大小還可對不同產物進行定量分析。AFA能夠同時分析多個SNP位點或檢測多個低拷貝數的病原體,大大提高了分析效率和準確性。
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