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片段分析原理

TA的每日心情

	衰 2025-6-6 15:34

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發(fā)表于 2024-9-2 14:33:09 | 只看該作者 |倒序?yàn)g覽 |閱讀模式

片段分析（Fragment Analysis, FA）的原理主要基于分子生物學(xué)技術(shù)，特別是針對由PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）過程所產(chǎn)生的DNA或cDNA片段進(jìn)行分析。這些片段的大小或標(biāo)記熒光的差異是分析的關(guān)鍵點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境、農(nóng)業(yè)研究等領(lǐng)域的基因型分型、DNA指紋分析、突變檢測等。以下詳細(xì)闡述片段分析的原理：

1. 技術(shù)基礎(chǔ)

PCR擴(kuò)增：首先，從生物樣本（如組織、血液、痰液）中提取核酸（DNA或RNA），制備成模板和引物，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。這一步的目的是產(chǎn)生大量的目標(biāo)DNA片段。
熒光標(biāo)記：在PCR過程中，使用熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行擴(kuò)增，使得PCR產(chǎn)物帶有熒光標(biāo)記。不同大小的片段可以采用不同顏色的熒光進(jìn)行標(biāo)記，以便于后續(xù)分析。

2. 分離與分析

電泳分離：擴(kuò)增后的熒光標(biāo)記DNA片段通過電泳技術(shù)進(jìn)行分離。電泳方法包括凝膠電泳（如瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳）、高效液相色譜法（HPLC）、變性高效液相色譜分析（DHPLC）以及毛細(xì)管電泳等。
- 瓊脂糖凝膠電泳：利用瓊脂糖作為支持介質(zhì)，通過電場作用使DNA片段根據(jù)大小和構(gòu)型進(jìn)行分離。
- 聚丙烯酰胺凝膠電泳：分辨率極高，適合分離小片段DNA（5-500bp）。
- HPLC與DHPLC：以液體為流動相，通過高壓輸液系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)DNA片段的分離和檢測，DHPLC特別適用于基因突變篩查。
- 毛細(xì)管電泳：高效、快速、微量，是片段分析中較為先進(jìn)的技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于先進(jìn)片段分析（AFA）。
熒光檢測：在電泳過程中，利用熒光檢測器對帶有熒光標(biāo)記的DNA片段進(jìn)行識別和區(qū)分。

3. 數(shù)據(jù)分析

軟件分析：通過專門的軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，確定DNA片段的大小和基因型。
- 大小分析：軟件利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和熒光標(biāo)記片段的比較，確定片段的相對大小。
- 基因型分析：根據(jù)用戶自定義的基因位點(diǎn)來分配等位基因，從而確定基因型。

4. 先進(jìn)片段分析（AFA）

AFA是片段分析中較為領(lǐng)先的技術(shù)，其核心內(nèi)容包括多重PCR技術(shù)和毛細(xì)電泳系統(tǒng)分離。在同一個PCR反應(yīng)體系中包含多對引物，各引物特異性地結(jié)合相應(yīng)的目的基因進(jìn)行多重PCR；通過毛細(xì)管電泳系統(tǒng)可對不同片段長度的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離和識別，同時根據(jù)峰面積的大小還可對不同產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。AFA能夠同時分析多個SNP位點(diǎn)或檢測多個低拷貝數(shù)的病原體，大大提高了分析效率和準(zhǔn)確性。